固定是組織處理最重要的一步，也是在整個制片過程中最無法補救的一步。所謂“固定”，就是組織離體后，用各種辦法

使其細胞內(nèi)的物質(zhì)盡可能接近其生活狀態(tài)時的形態(tài)結構和位置的過程。固定的目的是為了防止組織、細胞自溶與腐敗，防止細胞內(nèi)

酶對蛋白質(zhì)的分解作用，使細胞內(nèi)的各種成分如蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物或酶類轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)，以保持原有的結構與生活時

相仿。另外，組織固定后，具有硬化作用，增加了組織的韌性，有利于取材和組織脫水。如果標本沒有及時固定或固定不恰當，組

織已經(jīng)自溶或腐敗，將無法逆轉(zhuǎn)。

固定的注意事項：

（1）固定必須及時：組織離體后，必須立即固定（在1小時內(nèi)）。

（2）固定液的選擇：固定液的選擇非常重要，應該根據(jù)制作要求選擇合適的固定液。最常用的固定液是4%甲醛液或4%中性緩沖甲

醛液。

（3）固定液的量：必須大于組織體積的4-10 倍。

（4）固定液的濃度：濃度必須準確，過稀或過濃都會影響組織的形態(tài)和固定的效果。

（5）固定液的質(zhì)量：發(fā)現(xiàn)固定液變質(zhì)，如甲醛液體產(chǎn)生白色沉淀，應立即更換。

（6）固定的溫度：室溫或放于35-37℃的全封閉組織處理機內(nèi)，溫度過高，會加快組織的自溶和組織的過度收縮，并破壞細胞內(nèi)的

抗原和DNA。

（7）固定的時間：新鮮標本，應該剖開固定12-24小時后再取材。大標本取材后在室溫下還需再固定4-6小時，小標本取材后應該

在室溫下再固定3-4小時，如果是新鮮小標本取材，必須再固定4-8小時。如果室內(nèi)溫度低，固定時間還需延長。固定時間不超過48

小時。

（8）需要做分子病理的標本，從標本離體至組織脫水開始，總固定時間一般不要超過24小時（厚度2mm），同時決不要少于6小

時。

（一）最常用的固定液：

（1）4%甲醛液（10% 福爾馬林液）：甲醛（HCHO）是一種無色易溶的刺激性氣體。市售甲醛水溶液實際濃度為40%，易揮發(fā)，日久

會自行分解，產(chǎn)生白色沉淀(副醛：多聚甲醛或三聚甲醛)，并有甲酸產(chǎn)生，影響組織的固定和細胞核的染色。長期保存應該加入碳

酸鎂、碳酸鈣等碳酸鹽中和。我們用作病理標本固定的為4％甲醛水溶液（9份水加1份濃甲醛液，實際含甲醛4％，俗稱10% 福爾馬

林液）。甲醛是通過使蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)而產(chǎn)生固定作用，組織穿透性好，組織收縮小，HE染色對比鮮明 ，能完好地保存組織

的形態(tài)。但交聯(lián)和共價鍵的形成改變了蛋白的三維結構并覆蓋了抗原的決定簇，降低了組織的抗原性，因此，現(xiàn)在國際上都提倡使

用10%中性緩沖福爾馬林液。

優(yōu)點：①滲透能力較強，固定均勻。②收縮小。③能保存脂肪和類脂體（冰凍切片法）。④增加組織韌性。⑤有利于嗜銀染色。⑥

可固定高爾基體和線粒體。

缺點：①不能沉淀核蛋白的白蛋白。②溶解組織內(nèi)尿酸鹽結晶。③經(jīng)甲醛固定的陳舊組織較容易產(chǎn)生色素沉淀。（可用堿性乙醇去

除：濃氨水1ml加入75%乙醇200ml內(nèi)，切片脫蠟后浸入上述液體30分鐘；或者1%氫氧化鉀1ml加入80%乙醇100ml內(nèi)，切片脫蠟后浸入

上述液體10分鐘。如還沒有去除干凈，可以再延長，處理完成后流水沖洗5分鐘，常規(guī)染色）。

（2）4%中性緩沖甲醛液（10%中性緩沖福爾馬林液）：能完好地保存組織的形態(tài)，并使蛋白質(zhì)、核酸等大分子在細胞內(nèi)原位凝固沉

淀，防止這些物質(zhì)的崩解和彌漫流失，對大多數(shù)抗原和腫瘤基因等保存較好，是免疫組織化學和分子病理最常用的固定液，固定時

間24-36小時為宜。

4%中性緩沖甲醛固定液配方：甲醛100ml，蒸餾水900ml，磷酸二氫鈉（NaH2PO4?H2O）4g，磷酸氫二鈉（Na2HPO4）6.5g，用1N

NaOH調(diào)整pH至7.0。（由于國內(nèi)甲醛質(zhì)量不穩(wěn)定，取甲醛120ml，蒸餾水880ml，磷酸二氫鈉（NaH2PO4? H2O）4g，磷酸氫二鈉

（Na2HPO4）13g，效果更好）。

作者觀點：

（1）10%福爾馬林液是最常用的病理標本固定液，由于免疫組化和分子病理的開展，我們提倡使用10%中性緩沖福爾馬林液，以便

更好地保存抗原及腫瘤基因。我們對很多組織分別使用10％中性緩沖福爾馬林液和10%福爾馬林液固定后進行免疫組化結果對照，

雖然發(fā)現(xiàn)大多數(shù)抗原保存差異并不是很明顯，但是，對少數(shù)組織的抗原和FISH癌基因檢測（如Her-2）等影響較為明顯。因此應該

使用10％中性緩沖福爾馬林液，如果星期六、星期日休息的單位，應該在固定時間結束后，把組織長時間停留在75%乙醇、95%酒精

中。

（2）由于HE染色核的等電點pH為3.3-3.6，經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林液固定后，在一定程度上改變了細胞核的pH值，影響細胞核與

蘇木精染料的結合，導致細胞核容易發(fā)灰，特別是固定不充分的情況下。

（3）固定不佳的組織，由于脫水劑（乙醇）能使蛋白質(zhì)發(fā)生凝固，使脫水劑難以滲入到組織中去，造成組織脫水不佳；同時乙醇

又起到凝固性固定的作用，使交聯(lián)與凝固性固定在不同程度上混合，對抗原的保存起到了不良的影響（如AAF固定液）。因此，固

定是組織處理過程中最重要的一步：固定充分的組織，由于固定液已經(jīng)全部滲透到組織中去并與組織結合，細胞質(zhì)、組織結構都已

經(jīng)固定，脫水劑很容易將組織中的固定液和水分置換出來，因此固定好的組織很容易脫水；同時固定不足對抗原的影響遠遠超過了

固定過度所造成的影響。

（4）固定時間、固定液濃度與滲透速度：手術切除器官及腫瘤標本的固定和取材后標本的固定不盡相同，手術切除標本，由于具

有一定的立體外形、包膜等，固定液濃度過高，往往會過引起周圍組織收縮，影響固定液浸透到組織深處，造成組織中央固定不

佳；固定液濃度過低，容易造成組織邊緣水腫而組織中央固定不佳的現(xiàn)象。當手術標本過大時，如脾、腎、全胃、腸等臟器，由于

滲透速度的因素：10% 福爾馬林液固定液，24小時只能穿透2-3mm的實體組織和5mm的多孔疏松組織（滲透的速度受標本的致密度、

包膜的厚度、包膜外有無脂肪包裹、固定液的量、溫度等因素影響；而取材后的組織，上下二面組織被刀切過，固定液容易滲

透），如標本的厚度超過5mm，經(jīng)24小時固定后，通常只有靠近邊緣1-2mm左右的組織固定好，而中央的組織固定不佳，甚至腐爛。

因此此類標本應該切開固定，剖開標本厚度以3-5mm為佳，當標本超過厚度后，甲醛與組織的結合速度會變慢。

第二天取材后的標本，脫水前還應該固定6-8小時。

在一定范圍內(nèi)，固定液濃度高，所需固定時間短（但固定濃度過高，組織容易發(fā)硬，細胞收縮明顯）；而固定液濃度低，所需固定

的時間長（過低的固定液濃度，會導致組織水腫，還容易引起組織變質(zhì)）。因此合適的固定液濃度，不僅能快速的固定組織，還能

保存其優(yōu)良的細胞形態(tài)、結構和抗原。

（5）固定速度與溫度的關系：固定液溫度（加溫或室溫）越高，固定速度越快，所需的時間就越短，同時細胞收縮也越明顯，

抗原丟失也越多，過高的溫度還會加速組織的腐爛（當標本體積大，組織中間固定液還未滲透到的部分由于溫度升高，細胞開始變

質(zhì)）；反之，溫度低，固定速度就慢，過慢的固定速度同樣也會使固定液未滲透到的組織發(fā)生變性。因此選擇合適的厚度和固定溫

度非常重要，大體標本應該剖開后在室溫下固定，取材后標本可選擇室溫18℃-25℃固定。當室溫開始下降后，應該逐漸延長固定

時間，最好能在37-45℃恒溫箱（或在全自動恒溫密封式脫水機）內(nèi)固定。

（二）其它固定液：

（1）乙醇 CH3CH2OH：易燃、易揮發(fā)的無色透明液體，還原劑，可以被氧化成為乙醛，不能與鉻酸、重鉻酸鉀等氧化劑配成固定

液。優(yōu)點：①乙醇有固定，硬化和脫水的作用。②保存糖原可用100%乙醇固定。③在保存漿、膜抗原上比10%中性福馬林更好。缺

點：①滲透力較弱，容易造成表面發(fā)硬，固定液較難滲透到組織深部。②能沉淀核蛋白，但沉淀物溶于水，導致核的著色不良。③

可溶解血紅蛋白和損害多種色素。④固定速度較慢。⑤對某些抗原有損傷。⑥對核抗原保存不利。⑦能引起組織、細胞的收縮。

95%乙醇常用于細胞涂片固定，組織標本固定一般不采用，只有在沒有福爾馬林的情況下，才能臨時使用，等送到有福爾馬林的科

室后應立即更換。目前很多環(huán)保固定液均為醇性固定液。

圖1-12 95%乙醇固定的組織,組織表面硬化

（2）乙酸 CH3COOH ：又稱醋酸，由于該液體在氣溫16.6℃以下時，會結成冰狀固體，所以又稱冰醋酸。乙酸能沉淀核蛋白，使未

分裂細胞核的染色質(zhì)沉淀成塊狀，可以清楚地顯示細胞核的結構。乙酸滲透性強，固定快，可以使組織膨脹，因此最好與其它液體

配合使用。如甲醛乙酸液：10ml甲醛，5ml乙酸，85ml水，對于HE切片固定效果好，細胞結構清晰，染色對比鮮明。但乙酸不能沉

淀白蛋白，也不能固定脂肪、糖和類脂。

（3）苦味酸（ 2,4,6-三硝基苯酚）：黃色晶體，密度1.767，凝固點122.5℃，爆炸點300℃，常制成飽和溶液貯藏。能沉淀蛋白

質(zhì)，具有軟化組織的作用，同時還具脫鈣的作用。一般與其它液體配合使用，如Bouin液：飽和苦味酸水溶液75ml，甲醛20ml，乙

酸5ml。Bouin液是骨髓、睪丸等組織固定的良好固定液，適用于結締組織染色，尤其是三色染色時更為理想。由于固定液偏酸，pH

為1.7左右，對抗原有一定的損害，不適宜于標本的長期保存，固定時間12-24小時。經(jīng)苦味酸或Bouin液固定后的組織必須流水沖

洗4小時以上。

（4）B-5固定液（乙酸鈉-升汞-甲醛固定液）：滲透力較強，多用于固定淋巴組織。固定液配方：無水乙酸鈉1.25g，升汞6g，甲

醛10ml（用時加入），蒸餾水90ml。如果在此配方中不加甲醛，即為B-4固定液。凡使用B-5等用具有汞成分固定的組織，在染色

前，都必須先用0.5%碘酒（70%乙醇加入碘）脫汞處理。

（5）重鉻酸鉀 K2Cr2O7 ：橙紅色板狀結晶，與可燃物接觸可能著火。比重2.676，熔點398℃，有毒性。常用1%-3%水溶液作固

定，穿透力極強，組織收縮??；可使蛋白質(zhì)變?yōu)椴蝗苄裕荒苁沟鞍踪|(zhì)沉淀（但在溶液中加入乙酸后，也能使蛋白質(zhì)沉淀）；對線

粒體、高爾基氏體的固定效果較好。重鉻酸鉀固定液的缺點是可使染色質(zhì)溶解。經(jīng)重鉻酸鉀固定的組織必須流水沖洗12小時以上。

（6）戊二醛 C5H8O2： 帶有刺激性氣味的無色透明油狀液體。戊二醛對糖蛋白、糖原、微管、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞基質(zhì)等都有較好的固

定作用，穿透力比四氧化鋨強，能保存某些酶的活力，長時間的固定也不會使組織變脆。但不能保存脂肪，對細胞膜的顯示也較

差，也無電子染色作用，所以戊二醛（2.5%水溶液）只能作電鏡組織處理的前固定，固定時間需2小時以上。

（7）鋨酸OsO4 ：白色或淡黃色晶體，劇毒，強氧化劑，在使用時要注意對眼睛、呼吸器官、皮膚的保護。鋨酸對蛋白質(zhì)、脂肪、

脂蛋白固定良好。有較強的電子染色作用，組織樣本圖象反差好，所以鋨酸（1%水溶液）常作電鏡組織處理的后固定。固定時間視

環(huán)境溫度而有所不同，室溫高于18℃-20℃時1小時，低于18℃-20℃時1.5?2.0小時（屬作者個人經(jīng)驗）。缺點是固定時間過長容易

造成組織發(fā)脆，不容易切片。需在臨用前幾天配制以確保其充分溶解。

（8）Carnoy液：對于染色體固定較好，能很好地顯示DNA和RNA，固定速度快，一般3mm厚的組織塊固定1小時左右，較厚組織最好

也不要超過4小時。

固定液配方：乙酸10ml，氯仿30ml，無水乙醇60ml。

（9）Helly液：也稱Zenker福爾馬林液。對細胞質(zhì)的固定較好，特別是細胞質(zhì)內(nèi)的特殊顆粒、胰島以及心肌閏盤保存都有良好的效

果。因其含有汞成分，故在染色前，應先用0.5%碘酒（70%乙醇加入碘）脫汞處理。

固定液配方：重鉻酸鉀2.5g，升汞5g，蒸餾水100ml，甲醛5ml。

（10）Kanovsky液：對細胞抗原、微細結構的保存較單純使用戊二醛效果要好，常用于免疫電鏡標本的前固定，一般采用先灌注、

再浸泡的固定方法。固定時間10-30分鐘，然后用緩沖液漂洗。最后用蔗糖液浸泡，恒溫冷凍切片。

固定液配方：25%戊二醛10ml，40%甲醛5ml，0.2mol/L二甲胂酸鈉緩沖液49ml，無水氯化鈣50mg，蒸餾水33.5ml（最后加入），

pH7.3。

（11）Rossman液：常用于糖原的固定。組織固定12-24小時后，用95%乙醇洗，無水乙醇脫水。

固定液配方：無水乙醇苦味酸飽和液90ml，甲醛10ml。

（12）Zenker液：對免疫球蛋白、病毒包涵體（如Negri小體）的固定效果較好，細胞核和細胞質(zhì)染色比較清晰，常用于三色、磷

鎢酸-蘇木精等特殊染色的固定。對于含血量較多的標本不適合。固定時間12-36小時，加熱可加快固定作用。

固定液配方：儲存液由重鉻酸鉀2.5g，升汞5g，蒸餾水100ml 組成，用時再加入乙酸5ml。配法：將重鉻酸鉀和升汞加入蒸餾水，

加溫至40-50℃溶解，冷卻后過濾，保存于棕色玻璃磨砂瓶內(nèi)。此液不能用金屬容器盛放，組織固定后，也不能用金屬鑷子夾取，

如果此配方中的乙酸用甲醛代替即為Helly液。

用Zenker液固定后的組織必須流水沖洗12小時去除重鉻酸鉀（也可用亞硫酸鈉溶液或1%的氨水溶液洗滌），在脫水前要先用0.5%碘

酒（70%乙醇加入碘）脫汞處理。

（13）4%多聚甲醛液：常用于免疫組織化學組織的固定。

固定液配方：4g多聚甲醛，溶于100ml蒸餾水，加溫至60℃，攪拌溶解。多聚甲醛不容易溶解，也可將液體放于密封瓶中，60℃溫

箱過夜溶解。

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